Επιστήμονες αναγνώρισαν τη χημική ένωση από την οποία μπορεί να προήλθε η ζωή στη Γη

 

Κάποια στιγμή στην ιστορία της Γης, υπήρξε ένα κρίσιμο σημείο όπου οι χημικές αντιδράσεις ανάμεσα στα οργανικά μόρια ξεκίνησαν να σχηματίζουν κάτι βιολογικό. Η πρώτη μεταβολική αντίδραση παραμένει μέχρι σήμερα ένας τομέας υποθέσεων, ωστόσο μία ομάδα ερευνητών από το Rutgers University αναγνώρισαν μία πρωτεΐνη η οποία μπορεί να έπαιξε καίριο ρόλο στο ξεκίνημα της ζωής όπως την ξέρουμε.

Ο λόγος για ένα πεπτίδιο το οποίο αποκαλούν Nickelback. Η ονομασία προήλθε από την “ραχοκοκαλιά” της πρωτεΐνης, η οποία αποτελείται από μία αλυσίδα αμινοξέων και δύο άτομα υδρογόνου τα οποία συνδέονται με ένα ζεύγος ατόμων του νικελίου.

 

Οι επιστήμονες πιστεύουν πως κάποια στιγμή μεταξύ 3.5 και 3.8 δισεκατομμυρίων ετών πριν, υπήρξε ένα σημείο καμπής, κάτι που ξεκίνησε την αλλαγή από την προβιοτική χημεία – μόρια πριν τη ζωή – σε ζωντανά, βιολογικά συστήματα. Πιστεύουμε πως η αλλαγή προκλήθηκε από λίγες πρωτεΐνες οι οποίες πραγματοποίησαν βήματα-κλειδιά σε μία αρχαία μεταβολική αντίδραση. Και νομίζουμε πως βρήκαμε ένα από αυτά τα αρχικά πεπτίδια. – Vikas Nanda, βιοχημικός και μοριακός βιολόγος

Για να καταλήξουν σε αυτό το πεπτίδιο, οι επιστήμονες ξεκίνησαν με σύγχρονες πρωτεΐνες οι οποίες καθοδηγούν τις μεταβολικές διεργασίες σε πολλές βιοχημικές αντιδράσεις. Οι αρχαίες πρωτεΐνες θα ήταν πολύ απλούστερες, για αυτό οι επιστήμονες διέσπασαν τις πρωτεΐνες στα βασικά χαρακτηριστικά τους. Τα πειράματα ανέδειξαν το Nickelback ως ένα πιθανό υποψήφιο ο οποίος θα μπορούσε να σχηματιστεί στην προβιοτική Γη, αλλά ταυτόχρονα είναι αρκετά σύνθετο για να αντλήσει ενέργεια από το περιβάλλον και να παράγει κάτι με αυτήν.

Χρησιμοποιεί συνολικά 13 αμινοξέα, τα βασικά συστατικά των πρωτεϊνών δηλαδή και της ίδιας της ζωής πρακτικά. Το νικέλιο θα ήταν ένα άφθονο μέταλλο στους πρώτους ωκεανούς του πλανήτη μας. Όταν συνδέονται με τα πεπτίδια, τα άτομα του νικελίου δρουν ως καταλύτης και απελευθερώνουν αέριο υδρογόνο, το οποίο θα ήταν μία σημαντική πηγή ενέργειας πριν δισεκατομμύρια χρόνια.

Αυτό είναι πολύ σημαντικό, επειδή υπάρχουν πολλές θεωρίες σχετικά με την προέλευση της ζωής, αλλά πολύ λίγες εργαστηριακές δοκιμές για να δοκιμάσουν αυτές τις θεωρίες. Η δουλειά μας δείχνει πως όχι μόνο τα απλά πρωτεϊνικά μεταβολικά ένζυμα είναι πιθανά, αλλά πως είναι και πολύ σταθερά και πολύ δραστήρια, κάνοντάς τα μία σοβαρή πιθανότητα για το σημείο έναρξης της ζωής.

Η ανακάλυψη αυτή θα είναι χρήσιμη για να ξέρουμε ποιες βιοϋπογραφές να ψάχνουμε όταν ερευνούμε για ζωή σε άλλους πλανήτες.

Η έρευνα δημοσιεύθηκε στο Science Advances.

Εδώ μεταφρασμένη όλη η εργασία, για όσους θέλουν λεπτομέρειες.

Αφηρημένη

Οι προγονικές μεταβολικές διεργασίες περιλαμβάνουν την αναστρέψιμη οξείδωση του μοριακού υδρογόνου από την υδρογονάση. Τα υπάρχοντα ένζυμα υδρογονάσης είναι πολύπλοκα και περιλαμβάνουν εκατοντάδες αμινοξέα και πολλαπλούς συμπαράγοντες. Σχεδιάσαμε ένα πεπτίδιο 13-αμινοξέων που δεσμεύει το νικέλιο, ικανό να παράγει σθεναρά μοριακό υδρογόνο από πρωτόνια κάτω από μια μεγάλη ποικιλία συνθηκών. Το πεπτίδιο σχηματίζει ένα σύμπλεγμα δι-νικελίου δομικά ανάλογο με ένα σύμπλεγμα Ni-Fe στην υδρογονάση [NiFe] και το σύμπλεγμα Ni-Ni στην συνθάση ακετυλο-CoA, δύο αρχαίες, υπάρχουσες πρωτεΐνες κεντρικές στον μεταβολισμό. Αυτά τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι τα σύγχρονα ένζυμα, παρά την τεράστια πολυπλοκότητά τους, πιθανότατα εξελίχθηκαν από απλούς πρόδρομους πεπτιδίου στην πρώιμη Γη.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Στον σύγχρονο κόσμο, το μοριακό υδρογόνο (Η₂) χρησιμοποιείται μόνο ως πηγή ενέργειας από εξειδικευμένους μικροοργανισμούς σε αναερόβια περιβάλλοντα, αλλά νωρίς στην ιστορία της Γης, οι πρώτοι μικροβιοτικοί μεταβολισμοί σχεδόν σίγουρα εξαρτώνται από το Η₂ (1, 2). Η αναστρέψιμη βιολογική οξείδωση του Η₂ καταλύεται από υδρογονάσες, οξειδοαναγωγικά μεταλλοένζυμα με ενεργές θέσεις σιδήρου-σιδήρου (Fe-Fe), νικελίου-σιδήρου (NiFe) ή μόνο σιδήρου (Fe) (3, 4). Οι υπάρχουσες υδρογονάσες είναι πολύπλοκες νανομηχανές που περιλαμβάνουν εκατοντάδες αμινοξέα, πολλαπλές υπομονάδες και πολλαπλούς συμπαράγοντες μετάλλων που μεταφέρουν ηλεκτρόνια στην ενεργή θέση Ni-Fe (3). Οι φυλογενετικές μελέτες υποδηλώνουν ότι οι υδρογονάσες [NiFe] είναι προγονικές (4). Τα διαλυτά ιόντα νικελίου και σιδήρου ήταν πολύ πιο άφθονα κάτω από ανοξικές συνθήκες που χαρακτήριζαν τους ωκεανούς του Αρχαίου και του Προτεροζωικού από σήμερα (5, 6). Ωστόσο, οι πρώτες υδρογονάσες πρέπει να ήταν πολύ μικρότερες και απλούστερες. Μελέτες μοντέλων μιας ρουμπρεδοξίνης υποκατεστημένης με Ni υποδηλώνουν ότι μια μικρή πρωτεΐνη μπορεί να αναπτύξει Η₂ (7). Εδώ, αποδεικνύουμε ότι ένα πολύ βραχύ πεπτίδιο μπορεί εύκολα να σχηματίσει διπυρηνικά σμήνη Ni-Ni ικανά να εξελίξουν καταλυτικά το H₂. Τέτοια πεπτίδια είναι αρκετά απλά ώστε θα μπορούσαν να έχουν εμφανιστεί αυθόρμητα κατά τη διάρκεια ενός πρεβιοτικού σταδίου στην προέλευση της ζωής, δίνοντας αφορμή για τα πρώτα δίκτυα μεταβολικής αντίδρασης.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Υπολογιστικός σχεδιασμός πεπτιδίων

Στις υπάρχουσες υδρογονάσες [NiFe], τα μεταλλικά ιόντα ενεργού τόπου συντονίζονται από τέσσερις κυστεΐνες, κυανίδιο (CN−), μονοξείδιο του άνθρακα (CO) και νερό (Εικ. 1, αριστερά). Οι κυστεΐνες διαχωρίζονται από εκατοντάδες αμινοξέα, γεγονός που καθιστά δύσκολο τον σχεδιασμό ενός μικρού πεπτιδικού αναλόγου απευθείας από τη φυσική αλληλουχία. Αντίθετα, ερευνήσαμε ελάχιστες θέσεις δέσμευσης μετάλλων σε υπάρχουσες δομές πρωτεΐνης για γεωμετρίες συμβατές με τον συντονισμό ιόντων Ni²⁺ μέσα σε μια σύντομη, συνεχή περιοχή ακολουθίας (εικ. S1). Αντικαθιστώντας τα καρβοξυλικά με θειόλες σε μια υπάρχουσα θέση δέσμευσης ασβεστίου (8), εντοπίσαμε ένα πρότυπο CxCGCxxxxxCG. Οι θέσεις της μεταβλητής (x) επιλέχθηκαν υπολογιστικά χρησιμοποιώντας την καθοδηγούμενη από δομή πλατφόρμα σχεδίασης πρωτεΐνης protCAD (9), με αποτέλεσμα τα αρχικά σχέδια (βλ. Υλικά και Μέθοδοι για λεπτομέρειες). Ωστόσο, όπως περιγράφεται παρακάτω, οι τιτλοδοτήσεις δέσμευσης νικελίου έδειξαν στοιχειομετρία μετάλλου:πεπτιδίου 2:1, παρακινώντας μας να μοντελοποιήσουμε μια διπυρηνική θέση μέσα στο ίδιο ικρίωμα. Στο τελικό μοντέλο nickelback (NB) (Εικ. 1, μέση), ο συντονισμός μετάλλων μιμείται τα χαρακτηριστικά της θέσης ακετυλο-CoA (συνένζυμο Α) συνθάσης (ACS) δι-νικελίου Α-συστάδας (Εικ. 1, δεξιά). Όπως και στο φυσικό ACS, ένα μοτίβο CGC παρέχει δύο αμίδια ραχοκοκαλιάς (G4 και C5) και δύο θειόλες πλευρικής αλυσίδας (C3 και C5) για να συντονίζουν τον (απώτερο) συντονισμό ιόντων Ni²⁺ σε μια τετράγωνη-επίπεδη γεωμετρία. Οι θειόλες C3 και C5 χρησιμεύουν επίσης ως συνδέτες γεφύρωσης σε ένα δεύτερο (εγγύς) ιόν Ni²⁺ του οποίου ο συντονισμός ολοκληρώνεται με τις υπόλοιπες κυστεΐνες C1 και C12. Ορίζουμε εγγύς/άπω θέσεις Ni²⁺ με βάση την ονοματολογία από ισοδύναμες θέσεις ιόντων νικελίου στο ACS A-cluster και την υδρογονάση. Οι συντεταγμένες για τη λειτουργική θεωρία πυκνότητας (DFT)–βελτιστοποιημένο μοντέλο του NB-2Ni παρέχονται στο ModelArchive (εικ. S2) (10).

 

Εικ. 1. Μοντέλο δομής του NB και σύγκριση με φυσικά ένζυμα.

Η υδρογονάση [Ni-Fe] (αριστερά) (PDB ID: 5XLE) και η ACS (δεξιά) (PDB ID: 1RU3) είναι μεγάλες, πολύπλοκες πρωτεΐνες με ενεργές θέσεις διμετάλλων που συντονίζονται από μερικούς συνδέτες. Η δομή του μοντέλου του NB (μέση) συνδυάζει στοιχεία και των δύο ενεργών θέσεων σε ένα πολυπεπτίδιο 13 υπολειμμάτων.

 

Σύνθεση και ανασύσταση νικελίου

Το Apo-NB παρήχθη με σύνθεση στερεάς φάσης 9-φθορενυλ μεθοξυκαρβονυλίου και ανασυστάθηκε με άλατα Ni²⁺ στους 50°C. Το συγκρότημα συστάδας δι-νικελίου παρακολουθήθηκε με φασματοσκοπίες απορρόφησης υπεριώδους-ορατού και κυκλικού διχρωμισμού (CD) (Εικ. 2, Α και Γ). Ταυτοποιήθηκαν δύο οπτικά ενεργά είδη: ένα ενδιάμεσο στάδιο (2NB-1Ni) με τη στοιχειομετρία 2:1 (πεπτίδιο:Ni) και το ενεργό στάδιο (NB-2Ni) κορεσμένο σε στοιχειομετρία 1:2. Τα ισοβωτικά σημεία στα φάσματα CD (σημειωμένα με βέλη στο Σχήμα 2Α) υποδεικνύουν μια άμεση μετατροπή από 2NB-1Ni σε NB-2Ni κατά την ανασύσταση. Η φασματική αποσύνθεση των φασμάτων CD με ένα μοντέλο δύο συστατικών (εικ. S5 και S6) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των κλασματικών συγκεντρώσεων του 2NB-1Ni και του NB-2Ni κατά τη διάρκεια της πορείας της ανασύστασης Ni (Εικ. 2Β). Για να επιτραπεί η ποσοτική εκτίμηση των συγκεντρώσεων πεπτιδίου, εξετάστηκε επίσης μια παραλλαγή NB που περιέχει τρυπτοφάνη (NB-Trp, N8W) (σχήματα S7, S12 και S14).

 

`Εικ. 2. Συνδεσμολογία και δραστηριότητα της NB.

(Α) Φάσματα CD του NB ως συνάρτηση του προστιθέμενου Ni: [NB] = 750 μM (pH 7,5), θερμοκρασία = 50°C. Η κορυφή στα 340 nm (που αποδίδεται σε 2NB-1Ni) στην αρχή μεγαλώνει, φτάνοντας στο μέγιστο σε [Ni] = 450 μM (συμπαγής μωβ γραμμή) και στη συνέχεια μειώνεται σε ακόμη υψηλότερες συγκεντρώσεις [Ni]. Η κορυφή στα 430 nm (που εκχωρείται στο NB-2Ni) αρχίζει να αναπτύσσεται μόνο σε [Ni] > 500 μM και αυξάνεται μονότονα για να κορεσθεί γύρω από [Ni] = 1650 μM (συμπαγής μπλε γραμμή). Τα μαύρα βέλη δείχνουν ισοσβεστικά σημεία. (Β) Κλασματικές συγκεντρώσεις 2NB-1Ni και NB-2Ni όπως εξάγονται από τη φασματική αποσύνθεση δύο συστατικών των φασμάτων CD από το (Α), όπως φαίνεται στα Σχ. S5 και S6. Οι διακεκομμένες γραμμές ταιριάζουν χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ανασύστασης δύο βημάτων: apo-NB → 2NB-1Ni → NB-2Ni (εικ. S6). Τα ανώτερα όρια για τις σταθερές δέσμευσης Ni²⁺ εκτιμήθηκαν από την προσαρμογή ότι είναι περίπου 1 μM τόσο στο 2NB-1Ni όσο και στο NB-2Ni. Οι επαναλήψεις αυτής της ογκομέτρησης επιβεβαίωσαν τον κορεσμό μετάλλου πέρα από μια στοιχειομετρία πεπτιδίου-νικελίου 1:2 (εικ. S7). (Γ) Φάσματα απορρόφησης καθαρού 2NB-1Ni και NB-2Ni με χαρακτηριστικές ζώνες επισημασμένες. (D) Κύματα αναγωγής σε μαζικά διαλύματα CV πειράματα σε διαφορετικά στάδια ανασύστασης Ni σε NB: [NB] = 750 μM (pH 7,5), προστέθηκε [Ni] υποδεικνύεται για κάθε ίχνος (πλήρη ίχνη στα σχ. S14 έως S16). NHE - κανονικό ηλεκτρόδιο υδρογόνου. Το καταλυτικό ρεύμα στα -850 mV (κάθετη διακεκομμένη γραμμή) αρχίζει να αναπτύσσεται μόνο σε [Ni] > 500 μM και αυξάνεται γραμμικά με το κλάσμα NB-2Ni όπως φαίνεται στο (Ε). (F) Φωτοχημική εξέλιξη Η₂ από NB-2Ni (10 μM) με EosinY (500 μM) και TEOA (500 mM), φωτισμός 540 nm (pH 8) στους 37°C.

 

Δομική και χημική σταθερότητα

Οι μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) του NB-2Ni έδειξαν ένα κυρίαρχο μονοδιασπαρμένο είδος με ακτίνα ενυδάτωσης σύμφωνη με ένα συμπαγές μονομερές πεπτίδιο (εικ. S20). Το πλήρως ανασυσταθέν NB-2Ni επιβεβαιώθηκε ότι είναι σταθερό σε pH 5,5 έως 10 (εικ. S8), σε ένα ευρύ φάσμα θερμοκρασιών από 20° έως 90°C (εικ. S9), χωρίς σημάδια συσσωμάτωσης όταν αποθηκεύεται σε διαλύματα για αρκετούς μήνες και μάλιστα παρουσία μοριακού οξυγόνου ή διαλυμένου διττανθρακικού (εικ. S10 και S11). Σε ένα αρχαίο πλαίσιο της Γης, το NB-2Ni θα αναμενόταν να είναι σταθερό σε ένα εύρος προβλεπόμενων τιμών pH των ωκεανών και θερμοκρασιών που θα συναντούσαν οι πρώιμοι πεπτιδικοί καταλύτες κατά τη διάρκεια του Αρχαίου Αιώνα (11).

Η ενισχυμένη σταθερότητα του NB-2Ni πιθανότατα προέρχεται από τη συμπαγή, κλειστού κελύφους χηλική γεωμετρία του (Εικ. 1), όπου το τμήμα CNCGC παρέχει έναν σφιχτό συντονισμό τετραδοντίου και για τα δύο ιόντα Ni²⁺. Δεν υπάρχουν άλλοι συνδέτες κυστεΐνης που δυνητικά θα μπορούσαν να διασταυρωθούν και να οδηγήσουν σε ολιγομερισμό. Η γεωμετρία χηλίωσης κλειστού κελύφους του NB το διακρίνει από άλλα εξεταζόμενα πολυπεπτίδια που περιέχουν Cys, πολλά από τα οποία ολιγομερίζονται παρουσία Ni²⁺ και άλλων δισθενών μεταλλικών ιόντων (12, 13).

Δραστηριότητα οξειδοαναγωγής

Παράλληλα με τις οπτικές μελέτες, διερευνήσαμε την οξειδοαναγωγική δραστηριότητα τόσο των ενδιάμεσων συμπλοκών 2NB-1Ni όσο και των ώριμων συμπλεγμάτων NB-2Ni χρησιμοποιώντας κυκλική βολταμετρία (CV; Εικ. 2D και εικ. S16 έως S18). Τα είδη 2NB-Ni δεν εμφάνισαν οξειδοαναγωγική δράση. Το κύμα μείωσης σε σχήμα S αναπτύχθηκε μόνο σε υψηλές συγκεντρώσεις ανασυσταθέντος Ni²⁺ (Εικ. 2D), με το καταλυτικό ρεύμα στα -850 mV [έναντι τυπικού ηλεκτροδίου υδρογόνου (SHE)] να συσχετίζεται άμεσα με το κλάσμα των ειδών NB-2Ni (Εικ. 2Ε). Αυτό το δυναμικό οξειδοαναγωγής είναι περισσότερο από αρκετό για να οδηγήσει την αντίδραση εξέλιξης υδρογόνου (HER), με E0 = -440 mV σε pH 7,5.

Έλεγχοι κυστεΐνης-νικελίου

Μελέτες ελέγχου σε ελεύθερη κυστεΐνη που έχει συμπλοκοποιηθεί με μέταλλο έδειξαν ότι ενώ σχηματίζονται χηλικές ενώσεις νικελίου, έχουν πολύ διαφορετική δομή συντονισμού σε σύγκριση με το NB-2Ni όπως μετράται με CD (εικ. S19A). Οι χηλικές ενώσεις κυστεΐνης-Νί δεν σχημάτισαν μονοδιασπαρμένα είδη όπως μετρήθηκε με DLS (εικ. S20). Το CV επιβεβαίωσε ότι οι χηλικές ενώσεις κυστεΐνης-Ni δεν εμφάνισαν καταλυτικό ρεύμα σύμφωνο με την αναγωγική έκλυση υδρογόνου. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις είναι σύμφωνες με το NB-2Ni που σχηματίζει ένα σταθερό, μοναδικό σύμπλοκο συντονισμού ικανό για οξειδοαναγωγική χημεία που δεν μπορεί να αποδοθεί σε μη ειδικά σύμπλοκα μετάλλου-θειόλης ή χηλικές ενώσεις σε πεπτίδια πλούσια σε κυστεΐνη (12-14).

Φωτοκατάλυση

Η καταλυτική παραγωγή Η₂ από NB-2Ni αποδείχθηκε χρησιμοποιώντας μια φωτοχημική δοκιμασία με οργανική χρωστική (EosinY) ως φωτοευαισθητοποιητή και τριαιθανολαμίνη (TEOA) ως θυσιαζόμενο δότη ηλεκτρονίων που ακτινοβολήθηκε στα 540 nm (15). Η έκλυση Η₂ ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αέρια χρωματογραφία. Σε pH 8, προέκυψε ο αριθμός κύκλου εργασιών TON = 500 και η συχνότητα κύκλου εργασιών TOF = 0,2 H2/min (Εικ. 2F). Παρά το μικρό μέγεθος του NB, το TOF του είναι συγκρίσιμο με αυτό άλλων σχεδίων σύνδεσης Ni (0,1 έως 0,9 H2/min), ενώ το TON είναι μεγαλύτερο (16, 17).

EPR δομικός χαρακτηρισμός της μειωμένης κατάστασης

Ανιχνεύσαμε τη δομή της θέσης δι-νικελίου στο NB-2Ni με ηλεκτρονιακό παραμαγνητικό συντονισμό (EPR). Καθώς και τα δύο νικέλια βρίσκονται σε κατάσταση οξείδωσης 2+, η κατάσταση ηρεμίας του NB-2Ni δεν είναι ενεργή EPR. Προσθήκη του ισχυρού αναγωγικού ευρωπίου διαιθυλενοτριαμίνης πενταοξικού οξέος [Eu(II)DTPA, E0 = −1,1 V σε pH 8; (18)] απέτυχε να παράγει οποιαδήποτε ανιχνεύσιμη συγκέντρωση ανηγμένου NB-2Ni με ένα ηλεκτρόνιο, πιθανότατα λόγω του γρήγορου καταλυτικού κύκλου εργασιών HER με όλο το αναγωγικό να καταναλώνεται σε χρονική κλίμακα δευτερολέπτων και πριν καταψυχθεί το δείγμα. Ωστόσο, ήταν δυνατό να παγιδευτεί ένα ανηγμένο κατά ένα ηλεκτρόνιο NB-2Ni σε επαρκώς υψηλή απόδοση 10 έως 25% όταν προστέθηκε Eu(II)DTPA παρουσία μικρών προσδεμάτων, είτε CN− είτε διττανθρακικών, και μετά την αύξηση του pH σε 8 έως 10 (Εικ. 3Α και εικ. S21). Μια ανιχνεύσιμη απόδοση (10%) ανηγμένου με ένα ηλεκτρόνιο NB-2Ni ελήφθη επίσης με οξείδιο του δευτερίου (D₂O) χωρίς μικρούς υποκαταστάτες (εικ. S22). Το σήμα EPR ήταν πανομοιότυπο σε όλες τις περιπτώσεις, υποδεικνύοντας ότι οι μικροί υποκαταστάτες ή η δευτεριοποίηση διαλύτη απλώς επιβράδυναν τον κύκλο εργασιών αναγωγής, παγιδεύοντας έτσι σημαντικά κλάσματα σε κατάσταση μειωμένης κατά ένα ηλεκτρόνιο.

 

Εικ. 3. Δομικός χαρακτηρισμός του NB-2Ni.

Φάσματα EPR του (Α) ανηγμένου και (Β) οξειδωμένου NB-2Ni σε pH 10, μετρημένα στους 20 και 30 Κ, αντίστοιχα: συμπαγείς γραμμές, πείραμα. διακεκομμένες γραμμές, προσομοιώσεις EPR. Οι κύριες τιμές του παράγοντα g σημειώνονται με κάθετες γραμμές και αριθμούς. Το οξειδωμένο NB-2Ni στο (Β) μετρήθηκε απουσία (μπλε ίχνη) και παρουσία (κόκκινα ίχνη) προσδεμάτων ιμιδαζόλης (10 mM). (Γ) Η συμμετρία του παράγοντα g του ανηγμένου (οξειδωμένου) NB-2Ni είναι παρόμοια με το Ni¹⁺ στην υδρογονάση [NiFe] και το Ni³⁺ στο Ni-SOD όπου τα ιόντα Ni βρίσκονται σε σαφώς διαφορετικές θέσεις συντονισμού, π.χ., Ni¹⁺ και Ni³⁺, αντίστοιχα. Και οι δύο αυτές θέσεις Ni αντιπροσωπεύονται σε δι-νικέλιο NB-2Ni.

Το EPR της μειωμένης κατάστασης (Εικ. 3Α) ήταν χαρακτηριστικό μιας διαμόρφωσης ηλεκτρονίων d9 με Ni¹⁺ σε παραμορφωμένη οκταεδρική, τετραγωνική πυραμιδική ή τετράγωνη επίπεδη συντεταγμένη και με το ασύζευκτο ηλεκτρόνιο να βρίσκεται κατά προτίμηση σε ένα τροχιακό dx2-y2 (19, 20) . Και οι δύο θέσεις νικελίου στο NB-2Ni έχουν αυτήν τη συμμετρία συντονισμού στις δομές του μοντέλου μας (εικ. S2). Ωστόσο, μια περιφερική θέση Ni¹⁺ μπορεί να αποκλειστεί επειδή τα αμίδια ραχοκοκαλιάς θα εμφανίζονταν ως ισχυρές υπερλεπτές αλληλεπιδράσεις, οι οποίες δεν παρατηρήθηκαν (εικ. S21, S22 και S25 έως S29). Το μειωμένο Ni¹⁺ καταλαμβάνει πιθανότατα την εγγύς θέση (Εικ. 3C). Παρόμοιες υπογραφές Ni¹⁺ EPR έχουν αναφερθεί για την υδρογονάση [NiFe] (21) και την εγγύς θέση ACS (22), υποστηρίζοντας τη δομική ομολογία του NB-2Ni με αυτά τα δύο ένζυμα. Η ρομβικότητα του παράγοντα g, g = (2,27, 2,08, 2,05), στο ανηγμένο NB-2Ni είναι συγκρίσιμη με g = (2,26 έως 2,3, 2,11 έως 2,12 και 2,05) που ανιχνεύεται στο ανηγμένο με ένα ηλεκτρόνιο “Ni-L” κατάσταση της υδρογονάσης [NiFe], που λαμβάνεται με φωτόλυση σε χαμηλή θερμοκρασία του ενζύμου που έχει ανηγχθεί με Η₂ (21, 23). Ένα από τα υπολείμματα κυστεΐνης στην εγγύς θέση Ni¹⁺ στο Ni-L προβλεπόταν ότι θα πρωτονιωθεί (24). Τα πειράματά μας διαμόρφωσης φακέλου ηχούς σπιν ηλεκτρονίων (ESEEM)/συσχέτισης υπερλεπτού υποεπιπέδου (HYSCORE) επέλυσαν ένα ανταλλάξιμο πρωτόνιο σε απόσταση 2,5 Å από το εγγύς Ni¹⁺ στο NB-2Ni που είναι σύμφωνο με την προβλεπόμενη απόσταση από μια πρωτονιωμένη κυστεΐνη (εικ. S25 , S26, S28 και S29). Επιπροσθέτως, τα φάσματα ESEEM τριών παλμών του ανηγμένου NB-2Ni αναγνώρισαν ένα άτομο αζώτου σε απόσταση 3,1 Å που αποδόθηκε προσωρινά σε ένα κοντινό αμίδιο κορμού με βάση τις παραμέτρους πυρηνικής τετραπολικής σύζευξης (εικ. S27 και S30). Ενώ η παρουσία μικρών προσδεμάτων όπως το CN- ή το διττανθρακικό ήταν κρίσιμης σημασίας για την παγίδευση ανιχνεύσιμων συγκεντρώσεων του NB-2Ni με μειωμένο ένα ηλεκτρόνιο, όλα τα χαρακτηριστικά EPR μετρήθηκαν, συμπεριλαμβανομένων των τιμών του παράγοντα g καθώς και των υπερλεπτών/τετραπολικών συζεύξεων του το ανταλλάξιμο πρωτόνιο και το αμιδικό άζωτο, δεν επηρεάστηκαν παρά τη φύση των συντονιστικών συνδετών (σχήματα S21 έως S29). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι οι μικροί συνδέτες δεν εμπλέκονται στον άμεσο συντονισμό της εγγύς θέσης Ni¹⁺, και αντ' αυτού, αλληλεπιδρούν στην απομακρυσμένη (απώτερη) θέση Ni²⁺. Σύμφωνα με αυτό το συμπέρασμα, τα πειράματά μας EPR/ESEEM δεν αποκάλυψαν ανιχνεύσιμες μεταβάσεις από ¹⁴N CN− ή από 13C διττανθρακικό που θα αναμένονταν εάν συντονίζονταν απευθείας με την εγγύς θέση Ni¹⁺ (εικ. S21, S22 και S27).

EPR δομικός χαρακτηρισμός της οξειδωμένης κατάστασης

Αντίθετα, η οξείδωση του NB-2Ni με χλωριούχο ιρίδιο δημιούργησε ένα φάσμα Ni³⁺ EPR χαρακτηριστικό μιας διάταξης ηλεκτρονίων d7 με ένα μη ζευγαρωμένο ηλεκτρόνιο που βρίσκεται σε ένα τροχιακό dz2 (19, 20) και με μια συμμετρία παραγόντων g σύμφωνη με τετράγωνο-επίπεδο ή επίμηκες συντονισμός (Εικ. 3Β). Τόσο το σχήμα όσο και οι τιμές του παράγοντα g του οξειδωμένου σήματος NB-2Ni είναι πολύ παρόμοιες με εκείνες της οξειδωμένης υπεροξειδίου του νικελίου δισμουτάσης (Ni-SOD), όπου το Ni³⁺ βρίσκεται σε τετράγωνο-πυραμιδικό συντονισμό με δύο αμίδια ραχοκοκαλιάς, δύο κυστεΐνες και μια ιστιδίνη στην αξονική θέση (25). Ενώ το NB δεν περιέχει ιστιδίνη, η προσθήκη 10 mM ιμιδαζόλης στο οξειδωμένο NB-2Ni (Εικ. 3Β, κόκκινο ίχνος) ανακεφαλαιώνει την υπερλεπτή διάσπαση ¹⁴Ν που παρατηρείται στο Ni-SOD, που τώρα επιλύεται στο g1:1 = 2.014 κορυφή. Αυτό υποστηρίζει ένα Ni³⁺ στην απομακρυσμένη θέση στην οξειδωμένη κατάσταση (Εικ. 3C).

Με βάση αυτές τις εκχωρήσεις για τις καταστάσεις οξείδωσης του νικελίου, θα περιμέναμε ότι η αφαίρεση των C1 και C12 θα μπορούσε να εξαλείψει την εγγύς θέση ενώ θα διατηρούσε την απομακρυσμένη. Σχεδιάσαμε το NBΔP με C1 και C12 που αντικαταστάθηκαν από σερίνη. Τιτλοδοτήσεις νικελίου του NBΔP κορεσμένο σε σύμπλοκο 1:1, με διακριτό φάσμα CD σε σύγκριση με το NB-2Ni (εικ. S12). Το EPR του οξειδωμένου NBΔP-Ni είναι συγκρίσιμο με το οξειδωμένο NB-2Ni (εικ. S23), επιβεβαιώνοντας την αντιστοίχιση του Ni³⁺ στην απομακρυσμένη θέση. Από την άλλη πλευρά, η παγίδευση μιας μειωμένης κατά ένα ηλεκτρόνιο μορφής NBΔP-Ni με Eu(II)DTPA παρουσία ή απουσία μικρών προσδεμάτων ή σε δευτεριωμένο διαλύτη δεν ήταν επιτυχής. Δεν παρατηρήθηκε καταλυτικό κύμα για το NBΔP-Ni στο CV (εικ. S18), υποδεικνύοντας ότι το περιφερικό Ni από μόνο του είναι ανεπαρκές για την κατάλυση HER. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε καταλυτικό κύμα για σύμπλοκα ελεύθερης κυστεΐνης με Ni²⁺ (εικ. S19B).

ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Γενικά, η κατάλυση αναγωγής υδρογόνου περιλαμβάνει μια ακολουθία δύο σταδίων αναγωγής 1 ηλεκτρονίου και δύο σταδίων πρωτονίωσης (2H⁺ + 2e⁻ → H₂). Τα βολταμογράμματα NB-2Ni επέλυσαν μόνο ένα κύμα μείωσης (Εικ. 2D), υπονοώντας ότι τα δύο στάδια περιλάμβαναν αντιδράσεις αναγωγής ενός ηλεκτρονίου με επικαλυπτόμενα δυναμικά οξειδοαναγωγής. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι η αντίδραση μπορεί να προχωρήσει μέσω ενός μηχανισμού CECEC όπου τα δύο διαδοχικά στάδια αναγωγής ενός ηλεκτρονίου (Ε) διαχωρίζονται λειτουργικά από ένα βήμα πρωτονίωσης (C) (7, 26). Ο προτεινόμενος μηχανισμός CECEC είναι συνεπής με πειράματα τιτλοδότησης pH όπου το NB-2Ni, σε κατάσταση ηρεμίας, πρωτονιώνεται σε pH κάτω από 9 (εικ. S32). Ενώ η ακριβής φύση της πρωτονιωμένης κατάστασης NB-2Ni είναι άγνωστη, με βάση το φαινομενικό της pKa = 9,1, προτείνουμε την πρωτονίωση ενός υπολείμματος κυστεΐνης που συντονίζεται άμεσα σε μια κοντινή θέση Ni²⁺ στο NB-2Ni. Αυτή η πρωτονίωση της εγγύς κυστεΐνης σε κατάσταση ηρεμίας NB-2Ni μπορεί να είναι απαραίτητη για την προώθηση της αντίδρασης, καθώς και για τον συντονισμό του δυναμικού μείωσης του εγγύς Ni²⁺ σε λιγότερο αρνητικές τιμές, μειώνοντας αποτελεσματικά τις υπερδυναμικές απαιτήσεις. Η πρωτονίωση των θειολικών ομάδων κοντά σε ένα κέντρο Ni²⁺ είχε συζητηθεί ευρέως ως σημαντικά ενδιάμεσα σε έναν κύκλο αναγωγής υδρογόνου τόσο για σύμπλοκα μικρών μορίων όσο και για συστήματα που προέρχονται από πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένης της κατάστασης Ni-L στην υδρογονάση [NiFe] (7, 17, 23, 27).

Μελέτες για την υποκατεστημένη με Ni ρουμπρεδοξίνη έχουν δείξει ισχυρή εξέλιξη Η₂ με εμφανή TON μεταξύ 32 και 100, ανάλογα με τις συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και TOF ~0,5 min⁻¹ (7). Ενώ αυτοί οι αριθμοί είναι παρόμοιοι με εκείνους που λαμβάνονται με το NB-2Ni, με το σύμπλεγμα μας να δείχνει υψηλότερο TON, οι διαφορές στις συνθήκες ανάλυσης περιπλέκουν την πραγματοποίηση άμεσων συγκρίσεων. Αυτά και άλλα παραδείγματα υπογραμμίζουν τη δυνατότητα των ενζύμων νικελίου να έχουν παίξει κεντρικό ρόλο στον αρχαίο μεταβολισμό του υδρογόνου (28).

Οι κινητικές καταλυτικές παράμετροι του NB-2Ni είναι επαρκείς για να λειτουργήσουν ως βύθιση ηλεκτρονίων σε ένα μεταβολικό ημικύτταρο, όπου η εξέλιξη και η διάχυση του αερίου υδρογόνου θα μπορούσε να διατηρήσει μια ανισορροπία οξειδοαναγωγής. Υποθέτοντας συγκέντρωση πεπτιδίου 10 nM, λίγα μόνο μόρια ανά κύτταρο, χαμηλότερη από την αφθονία υδρογονάσης στους σύγχρονους οργανισμούς (29), το NB-2Ni θα μπορούσε να διατηρήσει μια σταθερή συγκέντρωση H₂ >20 nM (βλ. Συμπληρωματικά Υλικά για υπολογισμό). Για σύγκριση, ενεργοί μειωτές σιδήρου σε θαλάσσια ιζήματα έχουν παρατηρηθεί σε ~1 nM [H₂] (30, 31). Ένα πεπτίδιο που μοιάζει με NB θα μπορούσε εύλογα να χρησιμεύσει ως καταβόθρα ηλεκτρονίων σε πρώιμες μεταβολικές οδούς. Σημειωτέο, δεν έχουμε παρατηρήσει οξείδωση υδρογόνου σε αυτό το σύστημα. Για να οδηγηθούν μεταβολισμοί όπως η μεθανογένεση/ακετογένεση, θα έπρεπε να υπάρχουν καταλύτες οξείδωσης Η_`.

Απλά πεπτίδια που δεσμεύουν μέταλλα ικανά για αντιδράσεις οξειδοαναγωγής ήταν σχεδόν σίγουρα ένα ουσιαστικό βήμα στην αρχή της ζωής (24, 32). Επιπλέον, αυτά τα πεπτίδια είναι πιθανώς γενικά, ικανά να καταλύουν πολλές αντιδράσεις (33). Δεδομένης της ομοιότητας με τη θέση Α-συστάδας του ACS, είναι δελεαστικό να υποθέσουμε ότι η NB μπορεί να είναι σε θέση να μειώσει τα είδη άνθρακα. Αναμένουμε ότι η διερεύνηση του καταλυτικού δυναμικού του NB και παρόμοιων μεταλλοπεπτιδίων πέρα από το Η₂ θα μπορούσε να διαλευκάνει την πεπτιδική προέλευση πολλών από τα βασικά αρχαία δίκτυα μεταβολικής αντίδρασης (1, 34, 35).

Η κατασκευή υποψήφιων πεπτιδικών καταλυτών οδήγησε στην απροσδόκητη παρατήρηση ότι εξαιρετικά σύντομες αλληλουχίες αμινοξέων μπορούν να επιδείξουν σημαντική σταθερότητα και δραστικότητα. Παρόμοια με το NB-2Ni, η σχεδιασμένη πρωτεΐνη 12 αμινοξέων, η αμβιδοξίνη, συμπλοκοποιούσε ένα σύμπλεγμα 4Fe-4S με τέσσερις κυστεΐνες και ήταν ικανό για εκατοντάδες αναστρέψιμους κύκλους οξειδοαναγωγής (36). Η αμβιδοξίνη σχεδιάστηκε για να μιμείται την ενεργό θέση των βακτηριακών φερρεδοξινών, φυσικών πρωτεϊνικών φορέων ηλεκτρονίων που ήταν πέντε φορές μεγαλύτεροι. Αυτά τα δύο μεταλλοπεπτίδια υποδεικνύουν μια γενική προσέγγιση για μηχανικούς καταλύτες με δομική ανάλυση μεγάλων ενεργών θέσεων μεταλλοενζύμων. Η χημική σταθερότητα και το λειτουργικό δυναμικό των μικρών πεπτιδίων που συμπλέκονται με μέταλλα μεταπτώσεως τα καθιστούν εύλογους προγόνους στην εξέλιξη των οξειδορεδουκτασών και αμφισβητούν τη μακροχρόνια ιδέα ότι τα πρώιμα ένζυμα μπορεί να ήταν φτωχοί καταλύτες που απαιτούσαν βελτιστοποίηση της δραστηριότητας μέσω εκτεταμένης μοριακής εξέλιξης (33, 37). , 38).

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

Στρατηγική σχεδίασης

Η διπυρηνική θέση υδρογονάσης [Ni-Fe] συντονίζεται από τέσσερις κυστεΐνες που διαχωρίζονται από αρκετές εκατοντάδες υπολείμματα στη σειρά. Προς τον στόχο της ανάπτυξης ενός μινιμαλιστικού πεπτιδικού καταλύτη, εξετάσαμε θέσεις συντονισμού μετάλλων σε φυσικές πρωτεΐνες όπου οι συνδέτες ήταν πολύ πιο κοντά μεταξύ τους. Βάσει των προηγούμενων καταλυτών παραγωγής υδρογόνου με βάση το νικέλιο (7), ξεκινήσαμε με το σχεδιασμό μιας μονοπυρηνικής θέσης νικελίου.

Το αρχικό ικρίωμα βασίστηκε στη δομή υψηλής ανάλυσης μιας θέσης δέσμευσης Mn²⁺ στο C άκρο της παρβαλβουμίνης (39). Ένα ιόν μαγγανίου συντονίστηκε οκταεδρικά από τέσσερα καρβοξυλικά πλευρικής αλυσίδας, τρία από τα οποία ήταν στενά σε σειρά, με το μοτίβο DxDxD να υιοθετεί σφιχτές στροφές γύρω από το μέταλλο (εικ. S1A). Σε αυτή την περίπτωση, το μέταλλο ήταν πλήρως συντονισμένο, με πρόσθετο οξυγόνο καρβονυλίου και νερό. Δεδομένου ότι το Ni²⁺ είναι συχνά οκταεδρικό στις πρωτεΐνες (40), εξετάσαμε εάν μια προερχόμενη θέση που αντικαθιστά τα καρβοξυλικά με θειόλες θα δέσμευε κατάλληλα το νικέλιο.

Ξεκινώντας από τη δομή της παρβαλβουμίνης, τα υπολείμματα 90 έως 102, D90, D92, D94 και E102 αντικαταστάθηκαν με κυστεΐνη, ρυθμίζοντας τα περιστροφικά πλευρικής αλυσίδας να συντονίζουν βέλτιστα το ιόν νικελίου. Χρησιμοποιώντας το εργαλείο protEvolver στην πλατφόρμα μοριακής μοντελοποίησης protCAD, επιλέχθηκε η αλληλουχία των υπόλοιπων αμινοξέων χωρίς συνδέτη. Το protCAD είναι μια πλατφόρμα μοριακής μοντελοποίησης που επιτρέπει τη στρεπτική δειγματοληψία της σπονδυλικής στήλης και των βαθμών ελευθερίας της πλευρικής αλυσίδας, καθώς και αντικαταστάσεις ακολουθιών. Η βαθμολόγηση βασίζεται σε ένα πεδίο δύναμης που συνδυάζει τους μη δεσμευτικούς όρους AMBER ff14SB (41), τη βιβλιοθήκη Dunbrack bbdep rotamer (42) και την άρρητη επίλυση (9). Το protEvolver χρησιμοποιεί μια υλοποίηση γενετικού αλγορίθμου για τη γρήγορη δειγματοληψία του χώρου ακολουθιών και μπορεί να κλιμακωθεί ώστε να εκτελείται παράλληλα σε έναν αριθμό κόμβων υπολογισμού. Το protCAD και ο κώδικας protEvolver είναι ανοιχτού κώδικα και είναι διαθέσιμα για λήψη. δείτε Διαθεσιμότητα δεδομένων και υλικών.

Δημιουργήθηκαν αρκετές χιλιάδες δομικά μοντέλα. Οι κορυφαίοι μεταξύ αυτών υποβλήθηκαν σε εκτεταμένες προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής χρησιμοποιώντας AMBER (43). Τα μοντέλα διαλύθηκαν σε ένα στρώμα νερού 8- Å, χρησιμοποιώντας το μοντέλο νερού TIP3P (44) και το πεδίο δύναμης ff14SB (41). Το σύστημα ελαχιστοποιήθηκε στην πιο απότομη κάθοδο, ακολουθούμενη από ελαχιστοποίηση της συζυγούς κλίσης. Οι παράμετροι για το νικέλιο επιλέχθηκαν για να ευνοήσουν τον τετραεδρικό συντονισμό με μήκος δεσμού S-Ni 2,27 Å. Τα περιοδικά όρια τέθηκαν υπό σταθερό όγκο και το σύστημα θερμικοποιήθηκε από 0 έως 300 K χρησιμοποιώντας δυναμική Langevin και συχνότητα σύγκρουσης 3 ps−1. Οι προσομοιώσεις μοριακής δυναμικής εκτελέστηκαν για 3,0 μs στους 300 K. Οι υπολογισμοί πραγματοποιήθηκαν με ένα χρονικό βήμα 2-fs. Η δομική δειγματοληψία παρήγαγε μια παραμορφωμένη τετράγωνη-επίπεδη γεωμετρία συντονισμού νικελίου παρά τον καθορισμό τετραεδρικών περιορισμών. Αυτό έδειξε ότι υπήρχαν περιορισμοί στις υποθέσεις μοντελοποίησης και στη χρήση της μοριακής μηχανικής για την εξερεύνηση της μεταλλοπεπτιδικής δομής.

Διπυρηνικά μοντέλα και υπολογισμοί DFT

Η παρατήρηση μιας δεύτερης δέσμευσης νικελίου απαίτησε πρόσθετους συνδέτες μετάλλου πέρα από τις τέσσερις θειόλες κυστεΐνης. Στην υδρογονάση [Ni-Fe], πρόσθετος συντονισμός του σιδήρου παρείχε το κυανίδιο και το μονοξείδιο του άνθρακα, τα οποία δεν ενσωματώθηκαν ρητά ως μέρος της ανασύστασης μετάλλου. Αντίθετα, η θέση δι-νικελίου του ACS [Protein Data Bank (PDB) ID: 1MJG] και μεμονωμένα ιόντα νικελίου σε Ni-SOD (PDB ID: 1T6U) και η βοηθητική πρωτεΐνη υδρογονάσης [Ni-Fe], HypB, από αμίδια ραχοκοκαλιάς , μας οδήγησε να εξετάσουμε τα άζωτα αμιδίου της ραχοκοκαλιάς ως πιθανούς συνδέτες μετάλλων.

Εξετάστηκαν δύο εύλογα μοντέλα, ένα όπου το περιφερικό νικέλιο συντονίζεται από τις κυστεΐνες C1 και C3, το μοντέλο "CNC" (εικ. S2) και ένα όπου το απομακρυσμένο νικέλιο συντονίζεται από τις κυστεΐνες C3 και C5, το μοντέλο "CGC" ( εικ. S2). Τα μοντέλα κατασκευάστηκαν και δειγματολήφθηκαν με μοριακή δυναμική όπως περιγράφεται παραπάνω (διαθέσιμα αρχεία παραμέτρων μετάλλου-συνδέτη, βλέπε Διαθεσιμότητα δεδομένων και υλικών). Ακολουθήσαμε τη βελτιστοποίηση της μοριακής μηχανικής με τη γεωμετρική βελτιστοποίηση DFT και των δύο μοντέλων.

Οι υπολογισμοί βελτιστοποίησης γεωμετρίας μοντέλων CGC και CNC πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο κβαντικής χημείας ORCA (45). Οι αρχικοί γύροι υπολογισμών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του επιπέδου θεωρίας BP86 (46) χρησιμοποιώντας το σύνολο βάσης πόλωσης διαχωρισμένου σθένους def2-SVP της Καρλσρούης που εφαρμόστηκε σε όλα τα άτομα με το σετ βοηθητικής βάσης def2/J για προσαρμογή Coulomb και το def2-TZVP της Καρλσρούης σετ βάσης πόλωσης τριπλού ζήτα που εφαρμόζεται στα άτομα νικελίου (47). Η προσέγγιση split-RI-J χρησιμοποιήθηκε για την προσέγγιση των ολοκληρωμάτων Coulomb (48–50). Μετά τη σύγκλιση του αρχικού γύρου υπολογισμών, πραγματοποιήθηκε ένας δεύτερος γύρος υπολογισμών για την τελική δομή του CGC. Η δεύτερη σειρά βελτιστοποίησης χρησιμοποίησε το τμηματοποιημένο σύνολο ηλεκτρονίων σχετικιστικά συσταλμένο (SARC) Karlsruhe def2-TZVP σθένους πόλωσης τριπλού ζήτα (51) με το πλήρως αποσυμπιεσμένο βοηθητικό βασικό σύνολο def2/J (SARC/J) (52) για όλα τα άτομα εξαιρουμένου του νικελίου, το οποίο αντ 'αυτού χρησιμοποίησε το συσταλμένο σχετικιστικό σύνολο βάσης της Καρλσρούης ZORA-def2-TZVPP τριπλού ζήτα σθένους με δύο σετ συναρτήσεων πόλωσης που εφαρμόζονται στο νικέλιο και τα θεία συντονισμού. Χρησιμοποιήθηκε επίσης η προσέγγιση RIJCOSX (53), η οποία ενσωματώνει την ανάλυση προσέγγισης ταυτότητας (RI) και την προσέγγιση αλυσίδας σφαιρών (COSX) για το σχηματισμό πινάκων Coulomb και κβαντικής μηχανικής ανταλλαγής, αντίστοιχα. Ο χειρισμός των βαθμωτών σχετικιστικών επιδράσεων όλων των ηλεκτρονίων έγινε με τη χρήση της τακτικής προσέγγισης μηδενικής τάξης (ZORA) κλιμακωτή σχετικιστική Hamiltonian (54-56). Επιλέχθηκε ένα μεγάλο και συντηρητικό μέγεθος πλέγματος (DefGrid3 σύμφωνα με τη σύνταξη του ORCAs) μαζί με ένα αυστηρό αυτοσυνεπές όριο σύγκλισης πεδίου. Οι διορθώσεις διασποράς υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας τη διόρθωση διασποράς κατά ζεύγος ατόμων του Grimme DFT-D3(BJ) (57) με απόσβεση Becke-Johnson (58–60) και χρησιμοποιήθηκαν τόσο στον αρχικό όσο και στον δεύτερο γύρο υπολογισμών. Οι ενέργειες υδατικής διαλυτοποίησης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το μοντέλο πολώσιμου συνεχούς τύπου αγωγού (CPCM) (61) που εφαρμόστηκε στο ORCA. Μια κοιλότητα τύπου van der Waals χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία επιδράσεων ηλεκτροστατικής διαλυτοποίησης εντός του σχήματος φόρτισης Gauss (62). Ο διαλύτης νερού είχε μια διηλεκτρική σταθερά 80,4 ρυθμισμένη εντός της μονάδας CPCM.

Η απομακρυσμένη θέση νικελίου και στα μοντέλα CGC και CNC είναι τετράγωνη-επίπεδη (εικ. S2). Στο CGC, το εγγύς νικέλιο βρίσκεται στον τετραγωνικό-πυραμιδικό συντονισμό με τέσσερις ισημερινούς συνδέτες που περιλαμβάνουν τρία θεία (C1, C5 και C12), ένα οξυγόνο κορμού (R11) και έναν αξονικό συνδέτη θείου (C3). Η γεωμετρία συντονισμού του εγγύς νικελίου στο CNC είναι παραμορφωμένη τετράγωνη-επίπεδη, η οποία συντονιζόταν από τρία θεία (C3, C5 και C12) και ένα άζωτο (C12). Αυτό δεν συνάδει με τις μετρήσεις EPR, με αποτέλεσμα να εξαλείψουμε το μοντέλο CNC. Αντίθετα, η γεωμετρία συντονισμού του εγγύς νικελίου στο CGC ήταν σε συμφωνία με τις μετρήσεις EPR. Αν και το μοντέλο CGC είναι πιο συνεπές με το EPR, σημειώνουμε ότι δύο πρωτόνια α είναι κοντά στο εγγύς νικέλιο αλλά δεν παρατηρήθηκαν από το EPR, υποδεικνύοντας ότι η περαιτέρω ανάπτυξη του μοντέλου είναι ακόμα απαραίτητη. Τα μοντέλα CGC και CNC του NB-2Ni είναι διαθέσιμα στο ModelArchive (10) με τους αριθμούς πρόσβασης ma-6lwmo, ma-3g061 και ma-iyjyy.

Σύνθεση πεπτιδίων

Για την αρχική διαλογή πεπτιδίων, μικρές ποσότητες πεπτιδίων συντέθηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή σύνθεσης πεπτιδίων υποβοηθούμενη από μικροκύματα (Liberty Blue, CEM Corporations) όπως περιγράφηκε προηγουμένως (36). Εν συντομία, η σύνθεση διεξήχθη χρησιμοποιώντας τυπικές μεθόδους στερεάς φάσης με διϊσοπροπυλκαρβοδιιμίδιο (DIC) και αιθυλ (υδροξυιμινο) κυανοοξικό άλας (Oxyma) σε Ν,Ν'-διμεθυλοφορμαμίδιο και επακόλουθο καθαρισμό με καθίζηση αιθέρα και αντίστροφη φάση υψηλής πίεσης υγρή χρωματογραφία χρησιμοποιώντας στήλη C18 και βαθμίδωση Η₂Ο/ακετονιτριλίου με 0,1% τριφθοροξικό οξύ και στα δύο διαλύματα. Η ταυτότητα και η καθαρότητα των πεπτιδίων επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας ανάλυση φασματομετρίας μάζας εκρόφησης/ιονισμού λέιζερ υποβοηθούμενη από μήτρα. Το λυοφιλοποιημένο πεπτίδιο αποθηκεύτηκε στους -20°C μέχρι να χρησιμοποιηθεί.

Για λεπτομερή χαρακτηρισμό, το πεπτίδιο ΝΒ αγοράστηκε από την Genscript Biotech (Piscataway, NJ) ως λυοφιλοποιημένη σκόνη, η οποία αποθηκεύτηκε κατεψυγμένη σε κλάσματα μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Τα πεπτίδια σε αυτή τη μελέτη ήταν ως εξής: NB, CNCGCGNNNDRCG; NB-Trp, CNCGCGNWNDRCG (N8W); NBΔP, SNCGCGNNNDRSG (αφαίρεση της εγγύς θέσης, C1S/C12S).

Ανασύσταση νικελίου και τιτλοδοτήσεις

Λυοφιλοποιημένα πεπτίδια apo-NB διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 25 mM Hepes, 100 mM NaCl και 3,75 mM πρόσφατα παρασκευασμένο TCEP (υδροχλωρική τρις-2-καρβοξυαιθυλ-φωσφίνη), με ρΗ ρυθμισμένο σε 7,5 έως 9,2, για να δώσει μια τελική συγκέντρωση πεπτιδίου. από 0,75 έως 1,0 mM. Το διάλυμα apo-NB αποοξυγονώθηκε με καθαρισμό με 100% αέριο άζωτο για τουλάχιστον 20 λεπτά μέσα σε ένα αεροστεγές γυάλινο φιαλίδιο. Η ανασύσταση του νικελίου έγινε σε αεροστεγή οπτική κυψελίδα χαλαζία 1 cm σφραγισμένη με βιδωτό πώμα διαφράγματος. Η κυψελίδα τοποθετήθηκε μέσα στο διαμέρισμα δείγματος ενός φασματόμετρου CD (AVIV 420) με τον θερμοστάτη του φασματόμετρου ρυθμισμένο στους 50°C. Η πρόοδος στην ανασύσταση του νικελίου σε πεπτίδια NB παρακολουθήθηκε απευθείας μέσω των μετρήσεων CD. Προστέθηκαν ποικίλες ποσότητες Ni²⁺ από μητρικό διάλυμα NiCl₂ χωρίς οξυγόνο χρησιμοποιώντας καθαρισμένη σύριγγα Hamilton.

Για την κανονική ανασύσταση του νικελίου, η συγκέντρωση NiCl₂ που αντιστοιχεί σε 2 μοριακά ισοδύναμα πεπτιδίων NB προστέθηκε σε μία δόση, αναμίχθηκε με αναστροφή της κυψελίδας πολλές φορές και επωάστηκε στους 50°C για τουλάχιστον 2 ώρες ή όλη τη νύχτα. Η ανασύσταση σε θερμοκρασία δωματίου ήταν επίσης επιτυχής, αλλά χρειάστηκε σημαντικά μεγαλύτερους χρόνους έως και 48 ώρες. Η πρόοδος στην ανασύσταση Ni σε πεπτίδια παρακολουθήθηκε με περιοδική μέτρηση των φασμάτων CD μεταξύ 300 και 600 nm και η ανασύσταση θεωρήθηκε ότι είχε ολοκληρωθεί όταν τα φάσματα CD σταμάτησαν να αλλάζουν πλέον με περαιτέρω επώαση.

Για το πείραμα τιτλοδότησης νικελίου, μικρά (υποστοιχειομετρικά) κλάσματα NiCl₂ προστέθηκαν στα πεπτιδικά διαλύματα και η ολοκλήρωση κάθε σταδίου ανασύστασης παρακολουθήθηκε με φασματομετρία CD πριν από την προσθήκη περισσότερου NiCl₂. Η τιτλοδότηση θεωρήθηκε πλήρης όταν η περαιτέρω προσθήκη NiCl₂ δεν οδήγησε σε αλλαγές στα φάσματα CD. Εκτός από τα πειράματα CD, πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις CV στο ίδιο διάλυμα ανασύστασης σε επιλεγμένα στάδια συγκέντρωσης νικελίου όπως περιγράφεται παρακάτω.

Τιτλοδοτήσεις pH

Για να διερευνηθεί η επίδραση του pH στο συντονισμό του νικελίου στο NB-2Ni και στο ηλεκτροχημικό δυναμικό, το ρυθμιστικό διάλυμα του δείγματος τροποποιήθηκε ώστε να περιέχει 10 mM Ν-κυκλοεξυλ-2-αμινοαιθανοσουλφονικό οξύ (CHES), 10 mM φωσφορικό κάλιο, 10 mM MES και 10 mM Hepes, με 100 mM NaCl και 3,75 mM TCEP. Το pH σε κάθε βήμα ρυθμίστηκε χρησιμοποιώντας NaOH/HCl, με το διάλυμα να καθαρίζεται με άζωτο μετά από κάθε ρύθμιση. Η φασματοσκοπία CD χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση αλλαγών που εξαρτώνται από το pH στον συντονισμό NB-2Ni και η κυκλική βολταμετρία χρησιμοποιήθηκε για τις οξειδοαναγωγικές τιτλοδοτήσεις.

Μετατροπή τάσης δυναμόδωσης σε απορρόφηση

Η τάση της δύναμης στο φασματόμετρο CD μπορεί να μετατραπεί στην απορρόφηση χρησιμοποιώντας την ακόλουθη εξίσωση: Abs = 7,344 × log10 (DV1/DV0), με 7,344 ως κέρδος δύναμης (συγκεκριμένο για το φασματόμετρο CD μας), DV1 ως τάση δυναμόδωσης που μετράται ως μια συνάρτηση μήκους κύματος για το επιθυμητό δείγμα και DV0 ως τάση δυναμόδωσης που μετράται χρησιμοποιώντας τις ίδιες ρυθμίσεις για το τυφλό δείγμα (γραμμής βάσης).

Έλεγχοι l-κυστεΐνης

Για να διερευνηθεί η συμπεριφορά του μη ειδικού συντονισμού νικελίου, η l-κυστεΐνη ανασυστάθηκε παράλληλα με το πεπτίδιο NB χρησιμοποιώντας ισοδύναμες συνθήκες: 50 mM Hepes (ρΗ 7,5), 100 mM NaCl και 5 mM TCEP. NB (750 μΜ, που περιέχει τέσσερις κυστεΐνες στην αλληλουχία) ή 3 mM l-κυστεΐνη διαλύθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα και αποοξυγονώθηκε με καθαρισμό με αέριο άζωτο 100% για τουλάχιστον 20 λεπτά μέσα σε ένα αεροστεγές γυάλινο φιαλίδιο. NiCl₂ (1,5 mM) προστέθηκε σε καθένα από τα δείγματα για να διευκολυνθεί μια ισοδύναμη αναλογία τεσσάρων κυστεϊνών προς δύο Ni²⁺ και στα δύο. Οι ανασυνθέσεις επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ημέρες (48 ώρες) και παρακολουθήθηκαν με CD. Οι ηλεκτροχημικές τους ιδιότητες διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας κυκλική βολταμετρία.

Δυναμική σκέδαση φωτός

Πειράματα DLS πραγματοποιήθηκαν σε Zetasizer (v7.13, Malvern Panalytical Ltd.) σε αεροστεγείς κυψελίδες χαλαζία με καθαρισμό αζώτου χρησιμοποιώντας τα τυπικά πρωτόκολλα λειτουργίας του κατασκευαστή για τον προσδιορισμό μεγέθους της τυπικής πρωτεΐνης. Ρυθμιστικό διάλυμα, Ι-κυστεΐνη συν NiCl₂ (4Cys-2Ni) και NB-2Ni μετρήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Zetasizer v7.13.

Προετοιμασία δείγματος EPR

Όλες οι παρασκευές δειγμάτων πραγματοποιήθηκαν σε έναν αναερόβιο θάλαμο (CoyLabs βινυλικός θάλαμος), που περιείχε ένα μίγμα αερίου αζώτου (95%)/υδρογόνου (5%). Για να ληφθούν μειωμένα σύμπλοκα NB-2Ni, 100 μl των ανασυσταθέντων πεπτιδίων 2Ni σε συγκέντρωση 750 μΜ προεπωάστηκαν με 5 έως 50 mM διττανθρακικό νάτριο ή 5 mM K₄Fe(CN)₆ για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια αναμίχθηκαν με ίσου όγκου ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει 100 mM CHES (pH 9,8) ή Hepes (pH 7,5) και 50% (v/v) γλυκερόλη, πριν από τη διαδοχική προσθήκη 1,5 mM Eu(II)Cl2 (2 μοριακά ισοδύναμα σε σχέση με το NB-2Ni ) και 1,5 mM DTPA (18). Τα ανηγμένα πεπτίδια NB-2Ni σε δευτεριωμένα ρυθμιστικά διαλύματα D2O παρασκευάστηκαν παρομοίως, με την εξαίρεση ότι δεν προστέθηκαν διττανθρακικά ή κυανιούχα προσδέματα, και χρησιμοποιώντας μια μερικώς δευτεριωμένη d3-γλυκερόλη. Οξειδωμένα πεπτίδια NB-2Ni παρασκευάστηκαν ακολουθώντας παρόμοια διαδικασία με εξαίρεση την προσθήκη ενός οξειδωτικού Na₂IrCl₆·6H₂O 10 έως 50 mM κατά τη διάρκεια του τελευταίου σταδίου.

Η τελική συγκέντρωση των πεπτιδίων NB-2Ni σε όλα τα δείγματα EPR ήταν 375 μΜ. Μετά την ανάμειξη, τα δείγματα μεταφέρθηκαν αμέσως σε σωλήνες OD χαλαζία EPR 4 mm και στη συνέχεια σφραγίστηκαν με ελαστικά καπάκια προτού ληφθούν από τον αναερόβιο θάλαμο και καταψύχονται αμέσως σε υγρό άζωτο (περίπου 30 δευτερόλεπτα μεταξύ ανάμιξης και κατάψυξης). Τα κατεψυγμένα δείγματα σφραγίστηκαν με φλόγα και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο μέχρι τα πειράματα.

Φασματοσκοπία EPR

Όλα τα πειράματα EPR πραγματοποιήθηκαν με φασματόμετρο Bruker EPR (Elexsys580e) που λειτουργεί σε συχνότητα μικροκυμάτων ζώνης Χ. Οι κρυοστάτες ροής ηλίου (Oxford ESR900 και CF935) εξοπλισμένοι με ελεγκτή θερμοκρασίας Oxford (ITC503) χρησιμοποιήθηκαν για κρυογονικές θερμοκρασίες.

Πειράματα EPR συνεχούς κύματος έγιναν σε θερμοκρασία 20 K για τα ανηγμένα κέντρα NB-Ni¹⁺ και στους 30 K για τα οξειδωμένα κέντρα NB-Ni³⁺. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες πειραματικές ρυθμίσεις: συχνότητα μικροκυμάτων, 9,496 GHz; ισχύς μικροκυμάτων, 200 μW (μειωμένο NB-Ni¹⁺) και 2 mW (οξειδωμένο NB-Ni³⁺). πλάτος διαμόρφωσης, 1 έως 2 mT. Οι αποδόσεις συγκέντρωσης των ανηγμένων κέντρων NB-Ni¹⁺ ή οξειδωμένων NB-Ni³⁺ σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκαν συγκρίνοντας τις ενσωματωμένες εντάσεις των μετρούμενων σημάτων Ni^1+/3+ έναντι του προτύπου EPR με γνωστό αριθμό περιστροφών (κρύσταλλος CuSO₄·5H₂O γνωστού βάρος σε ορυκτέλαιο).

Πειράματα παλμικού EPR, συμπεριλαμβανομένων δύο παλμών ESEEM (π/2-τ-π-τ-ηχώ), τριών παλμών ESEEM (π/2-τ-π/2-T-π/2-τ-ηχούς), τέσσερα -παλμικό HYSCORE (π/2-τ-π/2-t1-π-t2-π/2-τ-ηχώ) και πυρηνικός διπλός συντονισμός ηλεκτρονίων Davies (βλ. παρακάτω) (63–66), πραγματοποιήθηκαν για τον χαρακτηρισμό της περιβάλλον πυρηνικής σπιν ανηγμένων/οξειδωμένων κέντρων Ni^1+/3+. Ο κύκλος φάσης χρησιμοποιήθηκε όπως απαιτείται σε κάθε παλμικό πείραμα για την εξάλειψη των συνεισφορών από ανεπιθύμητες ηχώ (63).

Πριν από τον μετασχηματισμό Fourier (FT), τα πεδία χρόνου ESEEM/HYSCORE διορθώθηκαν στη γραμμή βάσης προσαρμόζοντας τις ταλαντευόμενες διασπάσεις με εκτεταμένες συναρτήσεις εκθετικής διάσπασης, στη συνέχεια διαιρώντας την πειραματική διάσπαση με τη συνάρτηση προσαρμογής και, τέλος, αφαιρώντας μια μονάδα. Αυτή η διαδικασία διόρθωσης βασικής γραμμής οδήγησε σε φασματικές εντάσεις FT ESEEM που κανονικοποιήθηκαν αυτόματα σε ένα πλάτος σήματος ηχούς μονάδας. Αυτή η διαδικασία κανονικοποίησης μας επέτρεψε να συγκρίνουμε απευθείας τα φασματικά πλάτη στα φάσματα ESEEM που μετρήθηκαν για διαφορετικά δείγματα με διαφορετικές συγκεντρώσεις Ni^1+/3+, κ.λπ. (64).

Μετά το FT, εφαρμόστηκε γραμμική διόρθωση φάσης στα φάσματα FT για να διορθωθούν οι νεκροί χρόνοι που λείπουν. Στην περίπτωση του ESEEM δύο παλμών, ο νεκρός χρόνος (t₀) προσδιορίστηκε από μια αρχική καθυστέρηση τ μεταξύ των παλμών π/2 και π στο πείραμα. Στην περίπτωση του ESEEM τριών παλμών, ο χρόνος διόρθωσης υπολογίστηκε ως (τ + t₀), όπου τ είναι η σταθερή καθυστέρηση μεταξύ του πρώτου π/2 και του δεύτερου π/2 παλμών στην ακολουθία τριών παλμών και t₀ είναι η αρχική καθυστέρηση μεταξύ του δεύτερου και του τρίτου παλμού. Στην περίπτωση του HYSCORE, η γραμμική διόρθωση φάσης εφαρμόστηκε και στις δύο κατευθύνσεις με τον χρόνο διόρθωσης να υπολογίζεται ως (τ/2 + t₀) (67), όπου t₀ είναι η αρχική καθυστέρηση μεταξύ του δεύτερου και του τρίτου παλμού ή του τρίτου και του τέταρτου παλμού . Όλα τα φάσματα ESEEM/HYSCORE που παρουσιάζονται σε αυτήν την εργασία παρουσιάζονται ως κανονικοποιημένοι και διορθωμένοι κατά φάση συνημιτονικοί μετασχηματισμοί Fourier.

Άλλες πειραματικές ρυθμίσεις παλμικού EPR ήταν οι εξής: συχνότητα μικροκυμάτων, 9,776 GHz; μαγνητικά πεδία, 309 mT (ο προσανατολισμός πεδίου g_||) και 336 mT (ο προσανατολισμός πεδίου g⊥) για μειωμένα κέντρα NB-Ni¹⁺ και 345 mT (g_||) και 309 έως 318 mT (g⊥) για οξειδωμένο NB- Ni³⁺ κέντρα; παλμοί μικροκυμάτων π/2 και π, 16 και 32 ns, αντίστοιχα. αρχική καθυστέρηση τ, 104 ns (ESEEM δύο παλμών) και 40 ns (τριών παλμών ESEEM/HYSCORE). παράθυρο ενσωμάτωσης, 16 ns (ESEEM/HYSCORE) και 60 ns (EPR με ανίχνευση ηχούς με σάρωση πεδίου). χρόνους επανάληψης βολής, 1 έως 2 ms. και θερμοκρασία, 20 έως 30 K. Όλες οι προσομοιώσεις EPR/ESEEM πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την εργαλειοθήκη EasySpin για το MATLAB (www.easyspin.org/) (68).

Ηλεκτροχημεία

Όλα τα ηλεκτροχημικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αναερόβια ατμόσφαιρα με συνεχή καθαρισμό του αερίου αζώτου μέσω του διαλύματος και του άνω χώρου του ηλεκτροχημικού στοιχείου. Τα πειράματα CV ρυθμίστηκαν χρησιμοποιώντας έναν ποτενσιοστάτη Bio-Logic (EC50) και μια διάταξη τριών ηλεκτροδίων με ένα ηλεκτρόδιο Ag/AgCl (BASi) ως αναφορά και ένα σύρμα πλατίνας ως αντίθετο ηλεκτρόδιο. Ως ηλεκτρόδιο εργασίας χρησιμοποιήθηκε ένα γυάλινο ηλεκτρόδιο άνθρακα (3 mm, MF-2012, BASi) και γυαλίστηκε με πολτό αλουμίνας (1 μΜ) πριν από κάθε μέτρηση. Για κάθε πείραμα, 5 ml πεπτιδίου NB-Ni σε διάφορες συγκεντρώσεις γεμίστηκαν σε ένα κύτταρο Echem τριών θυρών και συνδέθηκαν με τα ηλεκτρόδια ενώ καθαρίζονταν το διάλυμα με Ν2. Κατά τη διάρκεια της σάρωσης βιογραφικού, η βελόνα καθαρισμού αποσύρθηκε από το διάλυμα ενώ εξακολουθούσε να καθαρίζεται ο χώρος κεφαλής. Τα δεδομένα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό EC-lab (V10.44) και στη συνέχεια διορθώθηκαν και αναλύθηκαν με βάση το MATLAB. Όλα τα δυναμικά που αναφέρονται σε αυτή την εργασία αναφέρθηκαν σε ένα SHE και υπολογίστηκαν ως E(SHE) = E(Ag/AgCl) + 205 mV.

Φωτοχημικά πειράματα

Η φωτοκαταλυτική δραστηριότητα των πεπτιδίων NB που έχουν ανασυσταθεί με Ni προς την εξέλιξη του Η2 εξετάστηκε παρουσία χρωστικής EosinY (−910 mV έναντι SHE) ως φωτοευαισθητοποιητή και TEOA ως θυσιαζόμενου δότη ηλεκτρονίων (15). Τα δείγματα [10 μM NB, 500 μM EosinY και 200-500 mM TEOA σε ρυθμιστικό διάλυμα Hepes (pH 8,0), με 100 mM NaCl] τυπικού όγκου 1 ml τοποθετήθηκαν σε αεροστεγή γυάλινα φιαλίδια των 13,5 ml σφραγισμένα με ένα 10 - Λαστιχένιο πώμα πάχους mm. Πριν από το φωτισμό, τα δείγματα καθαρίστηκαν με αέριο άζωτο για τουλάχιστον 20 λεπτά για να αφαιρεθούν τυχόν ίχνη οξυγόνου.

Τα δείγματα τοποθετήθηκαν στο κουτί επενδεδυμένο με φύλλο αλουμινίου από μέσα και φωτίστηκαν με πράσινο φως (540 nm) από δύο λαμπτήρες διόδου εκπομπής φωτός 5 W που είναι εγκατεστημένοι στην πηγή φωτός του μικροσκοπίου (εικ. S3). Η ένταση του προσπίπτοντος φωτός στα δείγματα ~0,2 mW/cm2 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μετρητή ισχύος φωτοδιόδου Ophir (Nova II με PD300-3W-V1). Κατά τη διάρκεια της φωτοχημικής αντίδρασης, η ποσότητα του αερίου Η2 που παρήχθη στον άνω χώρο των φιαλιδίων ανιχνεύτηκε περιοδικά χρησιμοποιώντας αέριο χρωματογράφο (SRI Instruments, Model 310) εξοπλισμένο με ανιχνευτή θερμικής αγωγιμότητας και χρησιμοποιώντας άζωτο ως φέρον αέριο.

 

Χρηματοδότηση: Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Grant του Ινστιτούτου Αστροβιολογίας της NASA «ENIGMA—Evolution of Nanomachines in Geospheres and Microbial Ancestors» (80NSSC18M0093) και το Ίδρυμα Gordon and Betty Moore με θέμα «Σχεδιασμός και Κατασκευή των Τρανζίστορ της Ζωής» (GBMF-4). (προς Β.Ν. και Π.Γ.Φ.). Το S.P. υποστηρίχτηκε από το Μεταδιδακτορικό Πρόγραμμα της NASA στο Αστροβιολογικό Ινστιτούτο, το οποίο διαχειρίζεται η Ένωση Διαστημικών Ερευνών των Πανεπιστημίων βάσει σύμβασης με τη NASA.